대장균의 세포질에서 생산될 수 있는 대체 항체 단편 형식의 설계

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 14188(2023) 이 기사 인용

측정항목 세부정보

접근성과 조직 침투력이 향상됨에 따라 항체 단편(Fab) 및 단일 사슬 가변 단편(scFv)과 같은 더 작은 항체 형식은 전체 길이 항체에 대한 효과적이고 저렴한 선택으로 잠재력을 보여줍니다. 항체의 모듈식 아키텍처에서 파생된 이러한 형식은 특정 치료 및 진단 응용 분야의 판도를 바꾸는 역할을 할 수 있습니다. 미생물 숙주는 항체 단편 형식의 생산 숙주로서 엄청난 가능성을 보여주었습니다. 그러나 단백질 접힘의 복잡성과 낮은 표적 단백질 수율로 인해 생산이 제한됩니다. 여기에서는 Fab의 접힘 및 생산과 관련된 몇 가지 주요 병목 현상을 극복하도록 설계된 대체 항체 단편 형식 'FabH3'을 보고합니다. FabH3 분자는 정전 조정 접근법을 기반으로 이종이량체화할 수 있는 조작된 면역글로불린 G1(IgG1) CH3 도메인으로 대체된 불변 도메인을 갖는 Fab 형식을 기반으로 합니다. 우리는 이 대체 항체 단편 형식이 Fab 대응물보다 더 높은 가용성 수율과 비교 가능한 결합 친화력을 갖는 기본적으로 접힌 상태에서 촉매화된 이황화 결합 형성 시스템(CyDisCo)을 사용하여 대장균의 세포질에서 효율적으로 생산될 수 있음을 보여줍니다. 표적 항원.

바이오치료제 중에서 단클론 항체(Mabs) 부문이 지배적인 시장 위치를 ​​차지하고 있지만, 이러한 추세는 새로운 항체 형식과 신약의 개발로 인해 점차 변화하는 것으로 보입니다1. 전장 단일클론 항체는 순환 반감기가 길어 특정 치료 및 진단 용도에 부적합할 수 있습니다2. 잠재적인 솔루션으로 항체 단편(Fab)이 바이오제약 산업의 핵심 플레이어로 등장했습니다. 이는 개선되고 깊은 종양 침투, Mab에 접근할 수 없는 특정 에피토프에 대한 결합, 잠재적으로 감소된 면역원성을 갖는 1가 항원 결합, 더 작은 항체 단편 형식보다 더 높은 안정성 및 더 빠른 제거와 같은 특정 이점을 제공합니다3,4,5. 치료제 및 진단제로서 항체 기반 분자의 다양한 적용으로 인해 수요가 증가하고 그에 따라 높은 수율로 생산할 필요성이 높아졌습니다.

많은 승인된 바이오시밀러 및 'me-too' 유형의 제품이 E. coli가 선택 숙주로 남아 있는 미생물 발현 시스템에서 생산되었습니다6. Fab 및 scFv 항체 단편은 당화되어 있지 않고 상대적으로 작기 때문에 E. coli에서의 생산은 기존 포유류 세포 배양 시스템보다 더 간단하고 경제적으로 실행 가능합니다. 항체 단편은 전통적으로 산화 주변세포질에서 또는 대장균의 환원 세포질에 봉입체로서 재조합적으로 생산되는 이황화물 결합 단백질입니다. 그러나 두 접근법 모두 관심 있는 단백질의 효율적인 생산에 심각한 병목 현상을 야기합니다. Fab의 주변세포질 발현은 주로 비효율적인 단백질 전위와 작은 부피의 주변세포질로 인해 낮은 단백질 수율을 초래하는 반면, 세포질 발현은 비천연 상태의 단백질 분해 및 봉입체로의 응집 측면에서 한계에 직면합니다. 시판되는 7개의 Fab 중 2개는 봉입체 형태로 대장균에서 생산됩니다3,7. Fab 접힘은 이황화 결합 형성, 시스-트랜스 프롤릴 이성질체화 및 제어된 올리고머화를 포함하는 복잡한 과정이므로 봉입체의 재접힘은 종종 비효율적이고 비용이 많이 듭니다8.

Fab 단편은 두 개의 공유 연결된 폴리펩티드 사슬, 즉 두 개의 불변 도메인 CH1 및 CL과 두 개의 항원 결합 가변 도메인 VH 및 VL을 각각 포함하는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로 구성됩니다(그림 1A). CH1 도메인은 본질적으로 무질서한 단백질이며 이황화 결합의 형성과 관계없이 펼쳐진 상태로 유지됩니다9. 항체 단편의 접힘에서 중요한 속도 제한 단계 중 하나는 CH1 도메인이 CL 도메인과의 상호작용에서만 일반적인 면역글로불린(Ig) 접힘을 채택하므로 불변 도메인의 결합입니다9,10. 또한, 공유 및 비공유 연결된 LC 이량체의 형성과 결합된 낮은 HC 안정성은 두 사슬의 합성 균형을 맞출 필요성을 보장합니다11,12. 최적의 Fab 발현을 위해 LC 및 HC의 다양한 번역 강도를 갖춘 구성을 설계하고 스크리닝하는 것은 힘들고 비용이 많이 들 수 있으며 반드시 성공하지 못할 수도 있습니다. Fab 분자에서 효율적인 이종이량체화를 유도하기 위한 여러 접근법이 있었습니다(예: Ojima-Kato et al.). 류신-지퍼 펩타이드 쌍이 불변 도메인(Zipbody)에 융합되는 것을 보고했습니다. 그러나 이는 태그 절단 단계에 대한 요구 사항과 후속 면역원성 문제로 인해 Fab의 치료 적용을 제한합니다.